目前，TPD技术在新疗法开发方面取得了显著成功。然而，该领域面临的主要瓶颈是E3连接酶的有限可用性。目前成功的TPD应用多使用E3连接酶底物受体，而单亚基E3连接酶在新靶标上的泛素化效率较低。尽管人类基因组中有600多个E3连接酶，但目前仅有12个被应用于TPD研究，临床试验中的PROTAC候选药物主要依赖于CRBN和VHL连接酶。这种E3连接酶使用的狭隘性引发了关注，因为癌细胞可能通过这些E3连接酶的突变或下调产生耐药性。扩展E3连接酶工具箱不仅有助于更广泛的蛋白质降解，还可能提高选择性，克服耐药性。更多E3连接酶的发现将显著推动TPD领域的进展，研究者们正为此进行巨大努力。在这里，我们讨论并提供对PROTAC和MGD降解物所招募的E3连接酶的现有方法以及潜在的新方法的见解，并强调它们的应用和局限性。
图1.在靶蛋白降解领域的E3连接酶反褶积策略总览
01、CRISPR筛选
CRISPR筛选是一种有效的工具，用于鉴定药物或化合物的蛋白靶标。在TPD的研究中，基于CRISPR的敲除筛选为鉴定PROTAC或MGD招募的E3连接酶提供了一种基于功能丧失的策略。目前主要有两种CRISPR敲除筛选策略：基于存活/抗性和基于报告基因的方法。基于存活/抗性的筛选依赖于细胞存活和药物抗性，适用于那些靶点蛋白对细胞生存至关重要的情况。基于报告基因的方法则通过荧光或发光报告基因标记，直接定量POI的降解，常用于研究降解剂（图2）。
图2.两种主要的CRISPR筛选策略用于鉴定PROTAC或MGD的E3连接酶
CRISPR筛选可以采用集合（pooled）或列阵（arrayed）两种格式。集合筛选将整个单导向RNA（sgRNA）库混合引入细胞中，施加选择压力后，通过比较有无选择压力的sgRNA丰度推断出与蛋白降解相关的基因。此方法可高效筛选许多基因，但解读复杂混合物的结果较为挑战。列阵筛选保持每个sgRNA分离，便于对每个基因功能进行直接测定，数据分析也相对简单。虽然列阵筛选需要专门的设备和自动化，但其对非增殖细胞、原代细胞或神经元细胞更为兼容（图3）。
图3.CRISPR筛选的集合式和列阵式
CRISPR筛选还有助于鉴定疾病相关细胞中必需的E3连接酶，有望利用这些信息开发新的降解物来克服疾病细胞的潜在抗性。尽管CRISPR筛选存在诸如E3连接酶冗余功能和必需E3连接酶无法被敲除等局限性，基于报告基因和汇集子库的方法仍然是高效、经济的策略，有助于研究和开发新的蛋白质降解剂。
02、基于亲和力的蛋白质组学
亲和基础的蛋白质组学方法在研究蛋白质相互作用和降解方面具有重要应用。通过PROTAC或MGD诱导E3连接酶与目标蛋白（POI）形成三元复合体，亲和基础的方法能够有效鉴定被招募的E3连接酶。例如，共免疫沉淀-质谱（co-IP-MS）和亲和纯化质谱（AP-MS）技术结合亲和标签或抗体，实现蛋白质相互作用的分析工作。大多数情况下，这些方法适用于通过稳定的相互作用形成的复合物，但也面临不适用于弱相互作用复合物的限制（图4）。
图4.基于亲和的蛋白质组学的一般工作流程
基于亲和力的蛋白质组学方法通常需要两种蛋白质之间的相对强的相互作用，因此稳定的三元复合物通常是快速有效降解的先决条件。
03、基于活性的蛋白分析（ABPP）
ABPP方法已用于鉴定多种E3连接酶。例如，通过isoTOP-ABPP分析鉴定了nimbolide与E3连接酶RNF114的结合，并验证了其抗癌活性。此外，这些方法也用于鉴定和验证基于光亲和标记的化合物，例如没有内在共价基团的化合物，通过光激活与附近蛋白质形成共价键，实现靶标蛋白的富集和分析（图5）。
图5.isoTOP-ABPP的一般工作流程
通过这些方法，研究人员可以更加精确地理解降解剂如何通过诱导E3连接酶与目标蛋白形成复合体，进而调控蛋白质降解。这些技术的应用为药物发现和生物学研究提供了强有力的工具，有助于深入探索复杂生物系统中的分子机制。
04、酶介导的邻近标记（PL）
酶介导的邻近标记技术（PL）用于识别小分子靶标，特别是PROTACs或MGDs招募的E3连接酶。PL能够识别强结合的伙伴关系，同时有效捕获瞬时和弱的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），克服了传统基于亲和方法的局限性。该技术利用与目标蛋白（POI）融合的生物素酶，在一定范围内生物素化邻近的内源蛋白。这些生物素化的蛋白质通过酶解和后续富集步骤（如链霉亲和素或抗生物素抗体）进行识别，最终通过质谱分析（LC-MS/MS）或western blotting鉴定（图6）。
图6.酶介导的接近标记的一般工作流程
05、热蛋白质组学（TPP）
热蛋白质组学（TPP）是结合了多重质谱和细胞热位移测定（CETSA）的新兴方法，用于研究新型PROTACs或MGDs招募的E3连接酶。TPP能在药物处理过程中监测整个蛋白质组的变化，分析蛋白质的热稳定性。CETSA通过逐渐升高温度，观察在药物存在与否情况下蛋白质的热稳定性。通常，药物结合的蛋白质表现出更高的热稳定性。这种方法适合研究PROTACs/MGDs引起的E3连接酶与POI之间的相互作用，通过E3连接酶的热稳定性增强进行识别（图7）。
图7.TPP的一般工作流程
06 、计算方法
计算技术可用于预测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），进而识别通过TPD技术作用于POI的E3连接酶。三元复合体的形成是实现快速有效蛋白质降解的关键。尽管存在挑战，但几种方法尝试预测三元复合体结构。目前，通过预测蛋白质之间的相互作用，识别E3连接酶还需进一步研究。然而，E3连接酶与POI之间的强相互作用可提高PROTACs开发的成功率，并为理性设计MGDs提供机会。通过经过验证的PPI预测方法，可预测600种E3连接酶与特定POI之间的结合。此外，利用AlphaFold等蛋白质结构预测技术，即使没有实验结构，现今大多数POIs和E3连接酶的结构已经可用，进一步促进了基于结构的PPI预测。
图8.各种不同策略的比较
07 、各种策略的应用和局限
开发基于PROTAC和MGD的药物正在引起广泛关注，因为TPD已成为解决未满足医疗需求的新策略。尽管目前已有多种策略用于鉴定E3连接酶，但它们仍然具有局限性，例如CRISPR筛选在无偏识别降解剂的E3连接酶时很有效，但其成本高、耗时且劳动密集；ABPP技术已成功鉴定共价E3连接酶配体并确定其结合位点。然而，使用化学蛋白组学识别E3连接酶可能具挑战性，因此，共co-IP-MS或PL方法可作为更佳选择；co-IP-MS适用于大多数实验室，适合共价和非共价结合剂，但需要稳定的三元复合体（图8）。综上所述，没有通用的方法适用于所有降解剂。方法选择应依据降解剂特性和具体实验条件。通常情况下，多种方法结合使用能更精确捕获E3连接酶。此外，无论使用何种方法，实验验证降解效应对于揭示E3连接酶至关重要。
参考文献
[1] Ligandability of E3 Ligases for Targeted Protein Degradation Applications
[2] Targeted protein degrader development for cancer: advances, challenges, and opportunities
[3] Targeted Protein Degradation: Current and Emerging Approaches for E3 Ligase Deconvolution
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