癌症免疫疗法—mRNA

mRNA疗法因其可以在体内表达已知蛋白质的优越性，已经成为癌症免疫疗法的前沿研究领域。特别是通过小剂量的mRNA递送，抗原呈递细胞（APC）可以合成突变新抗原和多抗原，并将表位呈递给T淋巴细胞引发抗肿瘤作用。此外，在特定免疫细胞中表达CAR、TCR、CD134等受体以及细胞因子、干扰素和抗体等免疫调节因子，可以增强针对肿瘤的免疫反应。然而，由于将mRNA递送至靶器官或细胞以及mRNA的内体逃逸效率不足，基于mRNA抗癌策略的临床转化受到限制。

近年来，基于mRNA的癌症免疫疗法取得了一些进展，大致可分为mRNA结构的修饰和递送系统（尤其是脂质纳米颗粒平台）的开发。

最近，中科院上海药物研究所于海军研究员和华东师范大学徐志爱教授在Exploration发表了一篇题为“From structural design to delivery: mRNA therapeutics for cancer immunotherapy”的综述文章，重点介绍了克服基于mRNA的癌症免疫治疗瓶颈的策略，例如mRNA不稳定性、先天免疫原性和较低表达效率。此外，还强调了设计最佳递送平台将mRNA转运至特定位点的进展，按靶器官和细胞分类（图1），讨论了递送系统中特定分子结构的功能，特别是具有靶向递送特性的 mRNA 载体，还阐述了目前基于 mRNA 的癌症免疫疗法临床应用的挑战和机遇。

▲图1 mRNA化学修饰和组织/细胞靶向递送原理示意图

基于mRNA的癌症免疫治疗的分子设计

mRNA是一种带负电荷的单链RNA，含有从DNA转录而来的遗传信息，并依靠核糖体翻译成蛋白质以实现特定的生命功能。这种脆弱的大分子结构决定了mRNA在富含各种肽和酶的体内环境中不稳定。此外，聚阴离子mRNA会排斥带负电荷的细胞膜（CM），使其难以进入细胞。IVT方法利用噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)在线性化DNA模板的指导下高保真地合成mRNA，但由于天然来源的mRNA与合成的mRNA之间存在差距，mRNA的蛋白表达不够有效，需要对mRNA结构和核苷酸进行进一步修饰。此外，内体逃逸的低效率显著损害了RNA药物的功效。例如，FDA 批准的 DLin-MC3-DMA LNP 只能介导 1-4% RNA 释放到细胞质中。

mRNA的先天免疫原性是另一个需要考虑的问题。外源mRNA作为免疫原而不是治疗药物，这是由mRNA的先天免疫原性决定的。APC特别通过模式识别受体（PRR）如Toll样受体（TLR）识别IVT mRNA，刺激I型干扰素（IFN-I，包括IFN-α和IFN-β）和促炎因子的分泌，从而显著损害mRNA的蛋白质表达过程。此外，IFN-I对于癌症免疫疗法的表现既有利又有害。它促进树突状细胞 (DC) 成熟、抗原呈递给 T 细胞以及 CD8 + T 细胞的激活。另一方面，IFN-I可以增加Treg和Th17细胞的数量，诱导髓源性抑制细胞(MDSC)的瘤内浸润，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。

在体内mRNA治疗的初期，注射到体内的mRNA会引起一系列异源免疫反应并被免疫系统裂解，就像机体正在对抗病毒的入侵一样，这极大地限制了mRNA治疗的应用。因此，克服mRNA免疫原性的技术突破至关重要。2005年，Katalin等人研究发现，用假尿苷替代尿苷可以降低mRNA激活DC的风险，不仅可以保护合成的mRNA免受免疫消除，还可以显著提高蛋白质表达的效率。这一发现解决了基于mRNA的治疗的担忧，从而拉开了mRNA临床应用的序幕。并在今年斩获诺贝尔生理学奖。除了核苷替换外，IVT-mRNA结构修饰还包括5'Cap、poly（A）尾和UTR。

▲图2 用于改进基于mRNA的癌症免疫治疗的mRNA结构修饰、佐剂添加、核苷修饰和密码子优化的示意图

提高mRNA稳定性和蛋白质表达效率的另一个策略是优化UTR序列，mRNA的UTR可分为5'和3'端。5' UTR 靠近 mRNA 的起始密码子，可以影响ORF翻译的速率。一份报告表明，没有复杂二级结构和起始密码子（如AUG和CUG）的较短5'UTR有利于启动mRNA的翻译过程，这些点在设计mRNA疫苗时值得考虑。3'UTR是常见的调控元件，也会影响mRNA的表达效率。有研究者筛选并获得了多个新型3'UTR，与一般3'UTR相比，显著提高了mRNA的蛋白翻译水平。

另外还有人通过分析内源基因表达并创新的设计UTR序列，筛选出了5' 和3' UTR的最佳组合，其蛋白质表达效率比内源UTR高5至10倍。此外，机器学习可以用于促进UTR序列设计。Castillo-Hair等人开发了一种基于实验数据训练的卷积神经网络模型，名为Optimus 5-Prime，该模型可以与算法相结合，从头设计UTR序列，提高翻译效率，加速在mRNA治疗中开发新型UTR的进程。

除此之外，mRNA的核苷修饰和密码子优化对于效率提升也很重要，例如5-甲基胞苷 (m5C)、N6-甲基腺苷 (m6A)、假尿苷 (Ψ)、5-甲氧基尿苷 (5moU) 和 1-甲基假尿苷 (m1 Ψ) 是用于mRNA重塑的主要修饰核苷酸，不仅提高了蛋白质翻译效率，还减少了mRNA的先天免疫激活。而由于密码子的简并性，同一蛋白质氨基酸序列存在数以亿计的密码子组合和二级结构，导致筛选具有最佳稳定性和翻译效率的mRNA核苷酸序列费时费力。最近，百度推出一种名为 LinearDesign 的人工智能 (AI) 和动态编程算法，可以缩短这个筛选过程，允许在大约十分钟内发现具有最佳序列的mRNA。

mRNA的癌症免疫治疗的递送系统

裸露的mRNA容易被体内普遍存在的RNase的降解，mRNA需要封装在递送平台中以增强其内体逃逸效率，这在随后的抗原呈递过程中起着至关重要的作用。多功能递送策略赋予mRNA靶向特定器官和细胞的能力，可以有效激活APC，并通过佐剂作用刺激免疫相关信号通路，从而显著提高抗肿瘤功效。一般来说，合适的递送系统有助于克服基于mRNA的癌症免疫治疗的瓶颈，例如靶向递送、提高转染效率和增强免疫反应强度。目前用于mRNA递送的技术平台包括LNP、水凝胶材料、聚合物递送和基于肽的递送方式，如下图所示。

▲图3 用于mRNA递送的 LNP、水凝胶、聚合物和基于肽递送示意图。

A. 具有羟基胆固醇替代的工程LNP，用于将 mRNA 传递至T细胞癌症免疫治疗。B. GLP-RO Gel和其他组处理后肿瘤重量变化图。C. 使用聚乙烯亚胺和GO水凝胶制备GLP-RO凝胶用于持久癌症免疫治疗。D. 用聚乳酸NP和CPP将 mRNA 递送至 DC 中以诱导有效免疫反应。E. 用于 mRNA 胞质递送的相分离肽，具有更高的稳定性和高转染效率。

总之，该综述详细总结了将 mRNA 精确运输到肿瘤细胞、DC、T 细胞、B 细胞和巨噬细胞等特定器官和细胞的研究，提出了基于mRNA 的癌症免疫疗法的临床转化将受益于 mRNA 设计中生物化学的深度整合，同时在靶向 mRNA 递送中采用材料和纳米技术有可能解决当下临床中面临的诸多挑战。由于篇幅有限，这里不再过多介绍，感兴趣的朋友可以详细阅读原文，了解最近mRNA癌症疗法领域的前沿进展和临床应用。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/EXP.20210146

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